活體定序(Live-seq)可行性嗎
發佈日期：2022-10-06
林口長庚醫院 檢驗醫學部盧章智教授
RNA定序(RNA sequencing)能夠讓我們研究細胞中基因表現。由於信息RNA(mRNA)是由DNA所產生,藉由信息RNA可識別原始DNA基因序列,進而測量這些細胞中各種基因的活性。由於自然界中大多數細胞多為群體的,要如何從群體中捕獲特定細胞的mRNA是目前RNA定序所面臨重要挑戰之一;為此,科學家們長久以來,一直努力來開發了單細胞RNA定序(scRNA-seq)的技術,期待能提高了對表徵細胞異質性能力的了解。
單一細胞對內部或外部刺激的反應是異質的,是眾所皆知的,所以要去理解細胞對於炎症信號或分化等擾動時,它所作出反應刺激的分子狀態之速度和程度是一大挑戰。這些主要原因是大多數全基因組分析方法必須破壞細胞,因而要在同一細胞上進行後續分子或表現型之實驗是不可能。
近年來為了解決此破壞性採樣的限制,已經開發了多種細胞分析方法,一般可分為兩類。第一類,純粹以電腦計算方法來處理,將根據快照測量推斷細胞的過去,如藉由相似的細胞狀態連接成一個連續的軌跡或藉由模型信使 RNA 剪接動力學(mRNA splicing dynamics)。但顯而易見的,這些工具生成的模型仍然以統計預期來解釋,而並非細胞實際的過渡路徑。然而,這些技術的功能是否在更長的時間內和單 一基因水平上正確推斷細胞的過去仍然存在很多爭議。第二類方法則將標記一個細胞或其部分分子。例如,以mRNA 的代謝標記可區分新舊合成的 mRNA 分子。或者,細胞可以被基因標記,它們的子細胞然後可以獨立跟踪其分子或表現型。雖然這些分子分析方法很強,但它們通常僅適用於短時間尺度或每個細胞之少數功能,並依賴於幾個生物學假設來推斷細胞的初始狀態。這些假設包括跨細胞和基因的同質退化(homogenous degradation)速率或分子狀態的維持代代相傳[例如,利用細胞碳複製(carbon-copying)方法],但這些會違反個別基因在不同層級的表現。
於2022年8月份自然(Nature)期刊上,由Wanze chen等人所發表,其標題「活體定序可分析單細胞之時間性轉錄組織紀錄Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells」;此活體定序Live-seq是一種單細胞轉錄組(a single-cell transcriptome)分析方法,利用流體力顯微鏡 (fluidic force microscopy),在 RNA 提取過程中,可保留細胞活力,從而利用加強Smart-seq2 RNA-seq來允許同時分析細胞的基態轉錄組(ground-state transcriptome)與其下游分子或表型行為,其簡單步驟及結果如圖所示。
圖: 活細胞定序( Live-seq) 乃結合適當 FluidFM 的活細胞活檢與增強的 Smart-seq2 RNA-seq。 (a)插圖和代表圖像為利用 FluidFM 之 Live-seq 採樣程序(此處,應用於棕色前脂肪細胞 IBA 細胞)。 白色箭頭表示應用低於或超壓。 黑色箭頭表示緩衝區和探針之提取量。 (b)應用於 IBA 細胞的 Live-seq 的質量控制根據每個面板上方列出的參數。 n = 10 個細胞。 nGene,檢測到的基因數量; nCount,所有基因的總數;百分比 MT, 線粒體基因計數的百分比。 誤差線代表平均值±標準差
為了對活體定序(Live-seq)進行基準測試,他們藉由細胞生長、功能反應和全細胞轉錄組讀數以證明活體定序可準確分層不同的細胞類型,這方法的關鍵是一種被稱為「流體力顯微鏡」,它使用比人類頭髮還細的微觀通道,其將力量與體積控制相結合,讓使用者將刺激物質插入至單個細胞,或從單個細胞中提取細胞質而不必殺死它們,包括mRNA。然後配合加強Smart-seq2 RNA-seq,此活體定序就可以在特定時間將轉錄組與後來分子或表型行為聯繫起來,也就是監測一個細胞中成千上萬個基因在不連續時間點的活動。科學家稱之為時間性轉錄分析,此研究可以準確地識別不同的細胞類型和狀態,而不會引起重大干擾。
此文章提到活體定序(Live-seq),它是一種利用細胞質活檢(cytoplasmic biopsy) 技術在進行轉錄組分析(transcriptome profiling)後,細胞還是可保持活力的,可以在不同的時間點對同一細胞進行單細胞轉錄組分析以及下游分子和功能分析,從而有機會解決與細胞動力學或細胞表型變異有關的一些長期存在的生物學問題。相信未來的下一代活體定序方法將會允許對更多細胞進行採樣,進而減輕相關的統計能力和細胞解析度問題。也更期待此活體定序技術可將把單細胞轉錄組學(single-cell transcriptomics)來轉化,以及可能的其他組學(omics)技術,如單細胞蛋白質組學(proteomics)和代謝組學(metabolomics),可從當前的終點類型測定轉變為時間分析工作流程。
參考資料:
1. Chen,W. et al. Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells. Nature, 1-8 (2022)
2. Saelens, W., Cannoodt, R., Todorov, H. & Saeys, Y. A comparison of single-cell trajectory inference methods. Nat. Biotechnol. 37, 547–554 (2019).
3. Hendriks, G.-J. et al. NASC-seq monitors RNA synthesis in single cells. Nat. Commun. 10, 3138 (2019).
4. La Manno, G. et al. RNA velocity of single cells. Nature 560, 494–498 (2018).
5. Picelli, S. et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat. Methods 10, 1096–1098 (2013).
RNA定序(RNA sequencing)能夠讓我們研究細胞中基因表現。由於信息RNA(mRNA)是由DNA所產生,藉由信息RNA可識別原始DNA基因序列,進而測量這些細胞中各種基因的活性。由於自然界中大多數細胞多為群體的,要如何從群體中捕獲特定細胞的mRNA是目前RNA定序所面臨重要挑戰之一;為此,科學家們長久以來,一直努力來開發了單細胞RNA定序(scRNA-seq)的技術,期待能提高了對表徵細胞異質性能力的了解。
單一細胞對內部或外部刺激的反應是異質的,是眾所皆知的,所以要去理解細胞對於炎症信號或分化等擾動時,它所作出反應刺激的分子狀態之速度和程度是一大挑戰。這些主要原因是大多數全基因組分析方法必須破壞細胞,因而要在同一細胞上進行後續分子或表現型之實驗是不可能。
近年來為了解決此破壞性採樣的限制,已經開發了多種細胞分析方法,一般可分為兩類。第一類,純粹以電腦計算方法來處理,將根據快照測量推斷細胞的過去,如藉由相似的細胞狀態連接成一個連續的軌跡或藉由模型信使 RNA 剪接動力學(mRNA splicing dynamics)。但顯而易見的,這些工具生成的模型仍然以統計預期來解釋,而並非細胞實際的過渡路徑。然而,這些技術的功能是否在更長的時間內和單 一基因水平上正確推斷細胞的過去仍然存在很多爭議。第二類方法則將標記一個細胞或其部分分子。例如,以mRNA 的代謝標記可區分新舊合成的 mRNA 分子。或者,細胞可以被基因標記,它們的子細胞然後可以獨立跟踪其分子或表現型。雖然這些分子分析方法很強,但它們通常僅適用於短時間尺度或每個細胞之少數功能,並依賴於幾個生物學假設來推斷細胞的初始狀態。這些假設包括跨細胞和基因的同質退化(homogenous degradation)速率或分子狀態的維持代代相傳[例如,利用細胞碳複製(carbon-copying)方法],但這些會違反個別基因在不同層級的表現。
於2022年8月份自然(Nature)期刊上,由Wanze chen等人所發表,其標題「活體定序可分析單細胞之時間性轉錄組織紀錄Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells」;此活體定序Live-seq是一種單細胞轉錄組(a single-cell transcriptome)分析方法,利用流體力顯微鏡 (fluidic force microscopy),在 RNA 提取過程中,可保留細胞活力,從而利用加強Smart-seq2 RNA-seq來允許同時分析細胞的基態轉錄組(ground-state transcriptome)與其下游分子或表型行為,其簡單步驟及結果如圖所示。
圖: 活細胞定序( Live-seq) 乃結合適當 FluidFM 的活細胞活檢與增強的 Smart-seq2 RNA-seq。 (a)插圖和代表圖像為利用 FluidFM 之 Live-seq 採樣程序(此處,應用於棕色前脂肪細胞 IBA 細胞)。 白色箭頭表示應用低於或超壓。 黑色箭頭表示緩衝區和探針之提取量。 (b)應用於 IBA 細胞的 Live-seq 的質量控制根據每個面板上方列出的參數。 n = 10 個細胞。 nGene,檢測到的基因數量; nCount,所有基因的總數;百分比 MT, 線粒體基因計數的百分比。 誤差線代表平均值±標準差
為了對活體定序(Live-seq)進行基準測試,他們藉由細胞生長、功能反應和全細胞轉錄組讀數以證明活體定序可準確分層不同的細胞類型,這方法的關鍵是一種被稱為「流體力顯微鏡」,它使用比人類頭髮還細的微觀通道,其將力量與體積控制相結合,讓使用者將刺激物質插入至單個細胞,或從單個細胞中提取細胞質而不必殺死它們,包括mRNA。然後配合加強Smart-seq2 RNA-seq,此活體定序就可以在特定時間將轉錄組與後來分子或表型行為聯繫起來,也就是監測一個細胞中成千上萬個基因在不連續時間點的活動。科學家稱之為時間性轉錄分析,此研究可以準確地識別不同的細胞類型和狀態,而不會引起重大干擾。
此文章提到活體定序(Live-seq),它是一種利用細胞質活檢(cytoplasmic biopsy) 技術在進行轉錄組分析(transcriptome profiling)後,細胞還是可保持活力的,可以在不同的時間點對同一細胞進行單細胞轉錄組分析以及下游分子和功能分析,從而有機會解決與細胞動力學或細胞表型變異有關的一些長期存在的生物學問題。相信未來的下一代活體定序方法將會允許對更多細胞進行採樣,進而減輕相關的統計能力和細胞解析度問題。也更期待此活體定序技術可將把單細胞轉錄組學(single-cell transcriptomics)來轉化,以及可能的其他組學(omics)技術,如單細胞蛋白質組學(proteomics)和代謝組學(metabolomics),可從當前的終點類型測定轉變為時間分析工作流程。
參考資料:
1. Chen,W. et al. Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells. Nature, 1-8 (2022)
2. Saelens, W., Cannoodt, R., Todorov, H. & Saeys, Y. A comparison of single-cell trajectory inference methods. Nat. Biotechnol. 37, 547–554 (2019).
3. Hendriks, G.-J. et al. NASC-seq monitors RNA synthesis in single cells. Nat. Commun. 10, 3138 (2019).
4. La Manno, G. et al. RNA velocity of single cells. Nature 560, 494–498 (2018).
5. Picelli, S. et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat. Methods 10, 1096–1098 (2013).