利用基因編輯釐清心血管疾病高危基因座的功能
發佈日期：2018-12-25
長庚大學教授 林口長庚醫院 婦產部主治醫師 王子豪
對慢性疾病的健康管理,我們必須一再強調「生活方式比遺傳體質更能決定疾病的發生」的重要性(參見新知分享專欄2018-11-19),然而遺傳體質也預設了先天的疾病風險。近十幾年來的全基因體關聯研究 (genome-wide association study, GWAS)至今發表了三萬多篇的論文,GWAS根據各種組合的單核酸多型性 (SNP, single nucleotide polymorphism)來找出許多疾病高危基因座 (loci) (參見新知分享專欄2018-7-16)。然而鑑定出疾病的高危基因座,對於機制的了解只是跨出第一步,有時後續研究很難進行;例如染色體9p21.3就是心臟血管疾病的高危基因座,雖然獨立於膽固醇等危險因子,它和10~15%的冠狀動脈疾病發生率有關。這個9p21.3的60,000核酸鹼基區域含有50到100個SNPs,但是不含編碼SNPs (coding SNPs);而且9p21.3是人類特有的核酸序列,也沒有動物模式可供利用。
要釐清9p21.3和心血管疾病的相關性必須面對三個挑戰:(1) 因為這段序列只出現於靈長類,沒有大鼠、小鼠動物模式可供使用;(2) 這段序列可稱為基因沙漠,因為不含編碼基因 (coding genes);(3) 雖然這段區域包含了一個長的非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)- ANRIL的末端,但是很難鑑定lncRNA的功能。
為了克服這些挑戰,一個加洲聖地牙哥Scripps研究院的硏究團隊先由心血管高危險群 (risk)和對照組 (non-risk)分別分離出19株同基因、人工誘導多功能幹細胞 (isogenic induced pluripotent stem cell lines,isogenic iPSCs),再於這些細胞株上進行單倍體基因型的基因編輯 (haplotype editing),最後獲得60,000核酸鹼基的同合子剔除 (homozygous deletion of the entire 60 kb haplotype in iPSCs)。haplotype editing則使用了轉錄激活因子樣效應物核酸酶 (TALENs, transcription activator-like effector nucleases)的平台。
高危單倍體基因型iPSCs 分化出來的血管平滑肌細胞 (VSMCs, vascular smooth muscle cells)生物特性和對照組不太一樣,高危VSMCs分裂比較快,比較不會貼附培養皿,收縮力也降低。一旦把高危單倍體基因型iPSCs 的9p21.3 (下圖的RR)剔除 (如下圖的RR KO),所衍生的血管平滑肌細胞的轉錄體和細胞功能就變回類似正常對照組(如下圖的NN)。正常對照組的細胞,再進行同合子剔除9p21.3功能則不太有改變(下圖的NN KO)。
以下圖來總結這個研究:首先由心血管高危險群 (Risk, 紅)和對照組 (Non Risk, 綠)分別分離出多株同基因、人工誘導多功能幹細胞 (isogenic iPSCs),接著利用TALENs在這些iPSCs上進行單倍體基因型編輯 (haplotype editing) (下圖的上半部);再把這些處理過的iPSCs誘導分化,陸續產生中胚層祖細胞(mesodermal progenitor, MP)和血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cells, VSMC) (下圖的下半部)。
高危單倍體基因型 (risk haplotype) 在9p21.3的60,000核酸鹼基序列雖然不含編碼基因,但在這上面的序列會經由調控選擇性剪接 (alternative splicing)影響lncRNA ANRIL的最後產物,而產生一個較短的ANRIL RNA isoform。本研究的資料更進一步地顯示,如果將這條較短的ANRIL RNA isoform 強迫表現於(over-express, 下圖的OE)對照組單倍體基因型iPSCs,就會出現高危VSMC的基因表現和特性,意即出現增生現象 (proliferative)、喪失貼附 (adhesive)與收縮(contractile)功能。
(下圖左側) 基因的網路分析(network analysis)可以看到在血管平滑肌細胞上,高危單倍體型在9p21.3的60,000核酸鹼基序列可以驅動大約3000個基因的表現,而剔除高危單倍體型的這個序列 (knock out, 下圖的KO),就可以將VSMC的基因表現變回對照組。
延伸閱讀:
Lo Sadro V et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell (2018) 175: 1796-1810.
對慢性疾病的健康管理,我們必須一再強調「生活方式比遺傳體質更能決定疾病的發生」的重要性(參見新知分享專欄2018-11-19),然而遺傳體質也預設了先天的疾病風險。近十幾年來的全基因體關聯研究 (genome-wide association study, GWAS)至今發表了三萬多篇的論文,GWAS根據各種組合的單核酸多型性 (SNP, single nucleotide polymorphism)來找出許多疾病高危基因座 (loci) (參見新知分享專欄2018-7-16)。然而鑑定出疾病的高危基因座,對於機制的了解只是跨出第一步,有時後續研究很難進行;例如染色體9p21.3就是心臟血管疾病的高危基因座,雖然獨立於膽固醇等危險因子,它和10~15%的冠狀動脈疾病發生率有關。這個9p21.3的60,000核酸鹼基區域含有50到100個SNPs,但是不含編碼SNPs (coding SNPs);而且9p21.3是人類特有的核酸序列,也沒有動物模式可供利用。
要釐清9p21.3和心血管疾病的相關性必須面對三個挑戰:(1) 因為這段序列只出現於靈長類,沒有大鼠、小鼠動物模式可供使用;(2) 這段序列可稱為基因沙漠,因為不含編碼基因 (coding genes);(3) 雖然這段區域包含了一個長的非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)- ANRIL的末端,但是很難鑑定lncRNA的功能。
為了克服這些挑戰,一個加洲聖地牙哥Scripps研究院的硏究團隊先由心血管高危險群 (risk)和對照組 (non-risk)分別分離出19株同基因、人工誘導多功能幹細胞 (isogenic induced pluripotent stem cell lines,isogenic iPSCs),再於這些細胞株上進行單倍體基因型的基因編輯 (haplotype editing),最後獲得60,000核酸鹼基的同合子剔除 (homozygous deletion of the entire 60 kb haplotype in iPSCs)。haplotype editing則使用了轉錄激活因子樣效應物核酸酶 (TALENs, transcription activator-like effector nucleases)的平台。
高危單倍體基因型iPSCs 分化出來的血管平滑肌細胞 (VSMCs, vascular smooth muscle cells)生物特性和對照組不太一樣,高危VSMCs分裂比較快,比較不會貼附培養皿,收縮力也降低。一旦把高危單倍體基因型iPSCs 的9p21.3 (下圖的RR)剔除 (如下圖的RR KO),所衍生的血管平滑肌細胞的轉錄體和細胞功能就變回類似正常對照組(如下圖的NN)。正常對照組的細胞,再進行同合子剔除9p21.3功能則不太有改變(下圖的NN KO)。
以下圖來總結這個研究:首先由心血管高危險群 (Risk, 紅)和對照組 (Non Risk, 綠)分別分離出多株同基因、人工誘導多功能幹細胞 (isogenic iPSCs),接著利用TALENs在這些iPSCs上進行單倍體基因型編輯 (haplotype editing) (下圖的上半部);再把這些處理過的iPSCs誘導分化,陸續產生中胚層祖細胞(mesodermal progenitor, MP)和血管平滑肌細胞 (vascular smooth muscle cells, VSMC) (下圖的下半部)。
高危單倍體基因型 (risk haplotype) 在9p21.3的60,000核酸鹼基序列雖然不含編碼基因,但在這上面的序列會經由調控選擇性剪接 (alternative splicing)影響lncRNA ANRIL的最後產物,而產生一個較短的ANRIL RNA isoform。本研究的資料更進一步地顯示,如果將這條較短的ANRIL RNA isoform 強迫表現於(over-express, 下圖的OE)對照組單倍體基因型iPSCs,就會出現高危VSMC的基因表現和特性,意即出現增生現象 (proliferative)、喪失貼附 (adhesive)與收縮(contractile)功能。
(下圖左側) 基因的網路分析(network analysis)可以看到在血管平滑肌細胞上,高危單倍體型在9p21.3的60,000核酸鹼基序列可以驅動大約3000個基因的表現,而剔除高危單倍體型的這個序列 (knock out, 下圖的KO),就可以將VSMC的基因表現變回對照組。
延伸閱讀:
Lo Sadro V et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell (2018) 175: 1796-1810.